PROGETTO

Sviluppo di candidati farmaci per la leishmaniosi dei tegumenti: sintesi di molecole natural-like, formulazione farmaceutica e correlazione clinico-terapeutica

1. Introduzione

La leishmaniosi è una malattia infettiva cronica endemica nelle aree tropicali e subtropicali, compreso il bacino del Mediterraneo, causata da un gruppo di parassiti protozoari intracellulari del genere Leishmania che vengono trasmessi all’uomo da insetti vettori (flebotomi). Si tratta di un’infezione dagli aspetti clinici molteplici da annoverarsi tra le prime dieci malattie “neglette”. Oltre a essere endemica in paesi tropicali, questa infezione è diffusa anche in Europa meridionale, sebbene non sia inserita nella lista di priorità dei sistemi sanitari nazionali e internazionali europei. Gli aspetti clinici di questa infezione sono molteplici in quanto le infezioni si possono infatti manifestare con lesioni cutanee o mucose (leishmaniosi dei tegumenti), oltre che con la forma viscerale (leishmaniosi viscerale), quest’ultima ad esito letale se non trattata tempestivamente. Negli ultimi anni, probabilmente a causa del global warming, si è assistito ad un aumento significativo dei casi di leishmaniosi tegumentaria nella regione Emilia-Romagna. In particolare, dal 2013 si è assistito ad una epidemia multi-annuale di leishmaniosi umana in provincia di Bologna e più in generale in Emilia-Romagna.

Il trattamento farmacologico della leishmaniosi si basa sulla somministrazione di un numero limitato di farmaci, che spesso risultano tossici e sono di difficile somministrazione. Un esempio è amfotericina B (AmB) liposomiale, associata a una minore incidenza di effetti collaterali rispetto ai corrispondenti farmaci antimoniali classici e ad altre formulazioni di AmB. In caso di infezioni causate da L. infantum l’impiego di miltefosina è controverso e richiede ulteriori studi. In questo contesto, emerge chiaramente la necessità di sviluppare nuove opzioni terapeutiche più efficaci, con effetti tossici minori ed economicamente accessibili. I calconi, sono una famiglia di molecole di origine naturale, largamente diffusi nel regno vegetale, dotate di una vasta gamma di bioattività. Per tale motivo in chimica farmaceutica sono considerate strutture privilegiate, ovvero strutture chimiche di base (scaffold) la cui opportuna funzionalizzazione può permettere di indirizzarne l’attività biologica verso un ambito terapeutico specifico.

2. Risultati e discussione

Il Progetto si è avvalso della collaborazione di un team multidisciplinare di esperti in Chimica Farmaceutica, Tecnologia Farmaceutica, Microbiologia e Dermatologia e si è focalizzato sullo sviluppo di potenziali candidati farmaci e metodiche per il trattamento della forma tegumentaria di leishmaniosi.

In particolare, sono stati sviluppati i seguenti obiettivi:

  1. Progettazione e sintesi di nuovi composti natural-like e relativa valutazione biologica circa il potenziale anti-Leishmania in termini di inibizione della crescita del parassita ed effetti tossici nei confronti dell’uomo. Tale fase ha permesso di identificare molecole lead, che saranno oggetto di studi successivi.

  2. Sviluppo di formulazioni liposomiali finalizzate a veicolare le molecole lead emerse nella fase 1 e quindi favorire la somministrazione locale e l’assorbimento in seguito a somministrazione cutanea. Valutazione dell’attività anti-Leishmania delle formulazioni liposomiali come strumenti di validazione.

  3. Ottenimento di isolati clinici da biopsie relative a lesioni di pazienti affetti da leishmaniosi tegumentaria. Le molecole migliori ed i sistemi nanoparticellari veicolanti le molecole biologicamente attive emersi ai punti 1 e 2, sono stati sottoposti a saggi sugli isolati clinici di leishmaniosi tegumentaria.

  4. Per le molecole migliori emerse al punto 1 è stata valutata la capacità di inibire la risposta infiammatoria associata all’infezione attraverso la determinazione del rilascio di citochine pro-infiammatorie. Inoltre, studi computazionali in silico finalizzati ad individuare il meccanismo di azione delle molecole più interessanti, hanno predetto la capacità di modulare l’azione di enzimi essenziali al parassita ed assenti nell’uomo quale ad esempio tripanotione riduttasi.

Per lo sviluppo degli obiettivi 1 e 2, il progetto si è avvalso della collaborazione tra il Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie e il Dipartimento di Medicina Specialistica, Diagnostica e Sperimentale, Azienda Ospedaliero-Universitaria di Bologna. Per il punto 3 hanno collaborato la dottoressa Gaspari e la professoressa Varani del Dipartimento di Medicina Specialistica. Per il punto 4, è stata inoltre sfruttata la collaborazione con l’Istituto Zooprofilattico della Sicilia, Gruppo di Ricerca e Sviluppo-Centro di Referenza Nazionale per le Leishmaniosi. È stata inoltre instaurata una nuova collaborazione con il Dipartimento Di Farmacia-Scienze Del Farmaco, Università di Bari per lo svolgimento di studi in silico allo scopo di individuare il meccanismo ed il sito di azione delle molecole più interessanti. Per quanto riguarda l’obiettivo 3 la collaborazione si è svolta presso l’Unità Operativa di Dermatologia Azienda Ospedaliero-Universitaria di Bologna.

2.1. Progettazione e sintesi di nuovi composti natural-like e relativa valutazione biologica.

2.1.1. Strategia di progettazione

Le strategie terapeutiche per la cura delle leishmaniosi umana attualmente disponibili impiegano farmaci obsoleti, caratterizzati da tossicità sistemica, insorgenza di reazioni avverse e sviluppo di resistenza. In questo ambito il processo di drug discovery per la scoperta di nuovi farmaci è ulteriormente ostacolato dagli scarsi incentivi finanziari così come dallo scarso interesse da parte delle grandi industrie farmaceutiche. Per far fronte a tali problematiche l’attenzione della comunità scientifica in ambito accademico si è indirizzata sullo studio dei prodotti naturali (natural products), molecole di origine naturale, e sui relativi analoghi ottenuti tramite sintesi chimica (natural-like compounds) i quali hanno dimostrato di possedere un’attività anti-Leishmania. In particolare, molecole naturali a struttura calconica, come ad esempio il licocalcone A, si sono distinti per l’efficacia anti-Leishmania associata ad una scarsa tossicità. Parallelamente, molteplici analoghi a struttura calconica sono stati sviluppati, caratterizzati da un buon profilo di attività.

Sulla base di tali evidenze, fulcro del progetto è stata la progettazione e la sintesi di alcune serie molecole (Serie 1 e 2) a struttura calconica correlate a composti lead precedentemente identificati e caratterizzate da una variabilità chimica per quanto riguarda i sostituenti agli anelli A e B, come potenziali agenti ad attività anti-Leishmania. La Serie 1 di analoghi è caratterizzata da un anello B 2′, 4′-di-cloro arilico mentre diversi sostituenti sono stati inseriti nelle posizioni 2 e 4 (R e R’) dell’anello A. La Serie 2 è caratterizzata da una funzione piridinica quaternaria avente una catena alifatica lineare e diversi sostituenti sono stati inseriti nelle posizioni 2 e 4 (R e R’) dell’anello A.

2.1.2. Sintesi chimica

La sintesi delle molecole calconiche si è basata sulla reazione di condensazione e aldolica di Claisen-Shmidt tra un acetofenone opportunamente funzionalizzato e l’aldeide disponibile commercialmente (3-O-4-piridin-cardossialdeideo 2,3-di Cl-benzaldeide). Tale reazione è nota per essere di facile esecuzione e quindi di permettere di ottenere efficientemente le molecole desiderate; una reazione di coupling ammidico permette di inserire una funzione ammidica. I calconi a struttura piridinica sono sottoposti alla Reazione di Metsinkin per ottenerne la funzionalizzazione con catene alifatiche lineari. Gli acetofenoni sono sintetizzati a partire dai precursori idrossilati, ai quali sono inserite catene alifatiche attraverso la reazione di alchilazione di Williamson.

2.1.3. Valutazione Biologica

Delle molecole è stata valutata l’attività (test di suscettibilità) nei confronti delle forme vitali del parassita di due specie di Leishmania: L. infantum e L. donovani ed in particolare su quella extracellulare (promastigoti), espressa come IC50 (concentrazione di composto in grado di inibire la crescita del parassita del 50%). Inoltre, per tali molecole è stata valutata la tossicità su cellule di mammifero, tramite saggi di citotossicità su cellule U937 ed espressa come CC50 (concentrazione citotossica di composto in grado di inibire la crescita delle cellule del 50%), al fine di definirne l’indice di selettività (selectivity index, SI), calcolato come rapporto tra CC50 e IC50.

Le molecole con attività antileishmania inferiore a 40 uM sono state riportate. Per le molecole migliori, emerse dai saggi in vitro, sono stati effettuati saggi anche sulla forma intracellulare (amastigoti) di L. infantum e L. donovani. Le stesse molecole sono state valutate su isolati clinici di Leishmania e per quanto riguarda l’effetto sulla liberazione di citochine pro-infiammatorie. Inoltre, il confronto tra determinate caratteristiche strutturali delle molecole analizzate e le relative attività anti-Leishmania, ha permesso di determinare la relazione tra struttura delle molecole e attività biologica (structure-activity relationship, SAR). Lo studio SAR, in ambito chimico farmaceutico, è utile per ricavare informazioni relative all’importanza, ai fini dell’attività, di determinati requisiti chimici, da sfruttare in una fase successiva di ulteriore ottimizzazione del profilo di attività. Un discreto numero di molecole ha dimostrato un interessante profilo di attività anti-Leishmania con valori di IC50 dell’ordine uM e con un SI favorevole. In particolare, le molecole più interessanti in termini di effetto antileishmania e SI sono le seguenti: 3130 (L. infantum: IC50=3.7 uM e SI=81.13; e L. donovani: IC50=4.41 uM, SI=67.99) e 3122 (L. infantum: IC50=4.9 uM e SI=16.58; e L. donovani: IC50=2.41 uM, SI=29.54). 3130 e 3122 sono stati valutati anche sulle forme intracellulari del parassita (amastigoti), le quali sono rilevanti per il trattamento clinico dell’infezione.

3. Studio formulativo: Sviluppo di formulazioni liposomiali e relativa valutazione biologica.

Le molecole lead 3130, 3122 sono state sottoposte a studi formulativi finalizzati al trattamento della forma cutanea dell’infezione che consiste nella inclusione in liposomi, utili per il trattamento intra-lesione. Tali formulazioni sono state preparate mediante metodo dello strato sottile seguito da sonicazione (metodo ad ultrasuoni).

Le formulazioni sono state processate con filtri a porosità 0.45 uM prima di essere utilizzate per i test microbiologici. Gli eccipienti utilizzati sono stati la fosfatidilcolina (PC), un fosfolipide ampiamente utilizzato nella preparazione di vescicole lipidiche o la PC associata alla stearilammina, una molecola lipidica carica positivamente capace di interagire con le fosfatidilserine presenti sulla membrana del parassita, inducendone la morte.

3.1.2. Caricamento delle molecole attive nei liposomi. I sistemi a base di PC sono stati caricati con le molecole denominate Lead 1, calcone 3130 e calcone 3122; mentre quelli a base di PC e stearilammina con il calcone 3130. Tutte le formulazioni ottenute sono state testate negli studi successivi, tranne quella con Lead 1 a causa della presenza di cristalli di attivo nel campione.

3.1.3. Caratterizzazione tecnologica dei liposomi. La valutazione delle dimensioni mediante Dynamic Light Scattering ha mostrato che tutte le vescicole hanno dimensioni nanometriche (inferiori a 300 nm) e una buona omogeneità dimensionale (indice di polidispersione inferiore a 0.3). L’efficienza d’incapsulazione, determinata mediante centrifugazione delle sospensioni liposomiali seguita da filtrazione del surnatante, ha evidenziato una buona capacità dei liposomi di incorporare le molecole attive (superiore al 70 %). La misura della carica superficiale mediante Zeta Potential Analyzer ha evidenziato un potenziale $\zeta$ negativo per i liposomi a base di PC (circa -20 mV) e positivo per quelli contenenti stearilammina (tra +20 e +50 mV).

3.2. Valutazione biologica delle formulazioni. Le formulazioni ottenute sono state testate in vitro in colture di Leishmania. In particolare, quelle contenenti i calconi 3130 e 3122, indipendentemente dal veicolo utilizzato, non sono risultate attive; la causa di tale risultato negativo potrebbe essere attribuita al fatto che, essendo molecole ad elevata lipofilia, potrebbero non essere rilasciate dalla formulazione e quindi non essere disponibili. Il liposoma contenente calcone 3122, molecola contenente una carica positiva e quindi meno lipofila rispetto alle due precedenti, è risultato essere attivo rispetto a 3122 non veicolato. Questo dato suggerisce che per questa molecola, la formulazione liposomiale è un utile strumento per aumentare la biodisponibilità, al contrario di quanto ottenuto per le molecole a elevata lipofilia.

4. Ottenimento di isolati clinici e loro impiego in saggi biologici

L’ottenimento di isolati clinici è stato effettuato presso l’ambulatorio di Dermatologia, tramite biopsie prelevate da lesioni in pazienti affetti da leishmaniosi tegumentaria. Tali isolati sono stati spediti a vari laboratori in Emilia-Romagna (Modena e Cesena), per la coltura, necessaria per il loro impiego nei successivi saggi biologici. In ambito ospedaliero, in caso di leishmaniosi si segue una procedura che inizia con la diagnosi di un nuovo caso, segue un trattamento farmacologico, e termina con l’osservazione della guarigione clinica. In particolare, per ogni caso sospetto, spesso evidenziato mediante dermatoscopia, viene effettuata una biopsia, utile a confermare la diagnosi e, eventualmente, la presenza delle forme amastigoti del parassita. Dalla biopsia viene infatti isolata la specie di Leishmania. Una volta confermato un nuovo caso di infezione, si raccolgono i dati del paziente, cercando di risalire al luogo del contagio; è necessario caratterizzare la lesione che può essere superficiale o estesa, oppure singola o multipla, sotto forma di papula o di nodulo; altre informazioni riguardano la sede della lesione, le dimensioni e se è ulcerata o meno. Il trattamento consiste in una somministrazione intralesionale di Glucantime (meglubina antimonianto), farmaco ad oggi approvato nel trattamento della leishmaniosi tegumentaria, adiuvata da crioterapia. La terapia viene ripetuta periodicamente (ogni due settimane), fino alla guarigione clinica, confermata mediante la dermatoscopia. Per ogni caso di leishmaniosi tegumentaria le informazioni relative al paziente ed alla cura eseguita vengono inserite in un database dell’OMS relativo ai casi della città di Bologna.

5. Conclusioni

Lo studio si è focalizzato sulla progettazione, sintesi e caratterizzazione strutturale di due serie di molecole a struttura calconica correlate ai lead compounds. Tali molecole sono state successivamente testate in vitro su colture di Leishmania mediante test di suscettibilità permettendo di identificare un discreto numero di molecole in grado di inibire la proliferazione del parassita. Per tali derivati è stata valutata la tossicità sistemica su colture di macrofagi, ai fini di determinarne l’indice di selettività. Due composti (3130 e 3122) sono risultati interessanti in quanto attivi anche sulla proliferazione della forma parassitaria intracellulare e sono stati inclusi in liposomi al fine di ottenere una formulazione farmaceutica idonea alla somministrazione locale, finalizzata al trattamento della leishmaniosi cutanea o tegumentaria. Inoltre, le molecole dotate di una buona attività antiparassitaria sono state sottoposte a studi in silico ai fini di indagare quale sia il bersaglio molecolare (target) coinvolto nell’attività inibente la proliferazione del parassita (Università di Bari). Nello specifico, come target è stata studiata la famiglia di enzimi appartenenti alla classe delle FAD/NADH deidrogenasi. È in fase di preparazione un manoscritto contenente i risultati sopra citati da sottomettere all’attenzione di una rivista scientifica a carattere chimico-farmaceutico.

La Ricerca

1. Introduzione

La leishmaniosi è una malattia infettiva cronica endemica nelle aree tropicali e subtropicali, compreso il bacino del Mediterraneo, causata da un gruppo di parassiti protozoari intracellulari del genere Leishmania che vengono trasmessi all’uomo da insetti vettori (flebotomi). Si tratta di un’infezione dagli aspetti clinici molteplici da annoverarsi tra le prime dieci malattie “neglette”. Oltre a essere endemica in paesi tropicali, questa infezione è diffusa anche in Europa meridionale, sebbene non sia inserita nella lista di priorità dei sistemi sanitari nazionali e internazionali europei. Gli aspetti clinici di questa infezione sono molteplici in quanto le infezioni si possono infatti manifestare con lesioni cutanee o mucose (leishmaniosi dei tegumenti), oltre che con la forma viscerale (leishmaniosi viscerale), quest’ultima ad esito letale se non trattata tempestivamente. Negli ultimi anni, probabilmente a causa del global warming, si è assistito ad un aumento significativo dei casi di leishmaniosi tegumentaria nella regione Emilia-Romagna. In particolare, dal 2013 si è assistito ad una epidemia multi-annuale di leishmaniosi umana in provincia di Bologna e più in generale in Emilia-Romagna.

Il trattamento farmacologico della leishmaniosi si basa sulla somministrazione di un numero limitato di farmaci, che spesso risultano tossici e sono di difficile somministrazione. Un esempio è amfotericina B (AmB) liposomiale, associata a una minore incidenza di effetti collaterali rispetto ai corrispondenti farmaci antimoniali classici e ad altre formulazioni di AmB. In caso di infezioni causate da L. infantum l’impiego di miltefosina è controverso e richiede ulteriori studi. In questo contesto, emerge chiaramente la necessità di sviluppare nuove opzioni terapeutiche più efficaci, con effetti tossici minori ed economicamente accessibili. I calconi, sono una famiglia di molecole di origine naturale, largamente diffusi nel regno vegetale, dotate di una vasta gamma di bioattività. Per tale motivo in chimica farmaceutica sono considerate strutture privilegiate, ovvero strutture chimiche di base (scaffold) la cui opportuna funzionalizzazione può permettere di indirizzarne l’attività biologica verso un ambito terapeutico specifico.

2. Risultati e discussione

Il Progetto si è avvalso della collaborazione di un team multidisciplinare di esperti in Chimica Farmaceutica, Tecnologia Farmaceutica, Microbiologia e Dermatologia e si è focalizzato sullo sviluppo di potenziali candidati farmaci e metodiche per il trattamento della forma tegumentaria di leishmaniosi.

In particolare, sono stati sviluppati i seguenti obiettivi:

  1. Progettazione e sintesi di nuovi composti natural-like e relativa valutazione biologica circa il potenziale anti-Leishmania in termini di inibizione della crescita del parassita ed effetti tossici nei confronti dell’uomo. Tale fase ha permesso di identificare molecole lead, che saranno oggetto di studi successivi.

  2. Sviluppo di formulazioni liposomiali finalizzate a veicolare le molecole lead emerse nella fase 1 e quindi favorire la somministrazione locale e l’assorbimento in seguito a somministrazione cutanea. Valutazione dell’attività anti-Leishmania delle formulazioni liposomiali come strumenti di validazione.

  3. Ottenimento di isolati clinici da biopsie relative a lesioni di pazienti affetti da leishmaniosi tegumentaria. Le molecole migliori ed i sistemi nanoparticellari veicolanti le molecole biologicamente attive emersi ai punti 1 e 2, sono stati sottoposti a saggi sugli isolati clinici di leishmaniosi tegumentaria.

  4. Per le molecole migliori emerse al punto 1 è stata valutata la capacità di inibire la risposta infiammatoria associata all’infezione attraverso la determinazione del rilascio di citochine pro-infiammatorie. Inoltre, studi computazionali in silico finalizzati ad individuare il meccanismo di azione delle molecole più interessanti, hanno predetto la capacità di modulare l’azione di enzimi essenziali al parassita ed assenti nell’uomo quale ad esempio tripanotione riduttasi.

Per lo sviluppo degli obiettivi 1 e 2, il progetto si è avvalso della collaborazione tra il Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie e il Dipartimento di Medicina Specialistica, Diagnostica e Sperimentale, Azienda Ospedaliero-Universitaria di Bologna. Per il punto 3 hanno collaborato la dottoressa Gaspari e la professoressa Varani del Dipartimento di Medicina Specialistica. Per il punto 4, è stata inoltre sfruttata la collaborazione con l’Istituto Zooprofilattico della Sicilia, Gruppo di Ricerca e Sviluppo-Centro di Referenza Nazionale per le Leishmaniosi. È stata inoltre instaurata una nuova collaborazione con il Dipartimento Di Farmacia-Scienze Del Farmaco, Università di Bari per lo svolgimento di studi in silico allo scopo di individuare il meccanismo ed il sito di azione delle molecole più interessanti. Per quanto riguarda l’obiettivo 3 la collaborazione si è svolta presso l’Unità Operativa di Dermatologia Azienda Ospedaliero-Universitaria di Bologna.

2.1. Progettazione e sintesi di nuovi composti natural-like e relativa valutazione biologica.

2.1.1. Strategia di progettazione

Le strategie terapeutiche per la cura delle leishmaniosi umana attualmente disponibili impiegano farmaci obsoleti, caratterizzati da tossicità sistemica, insorgenza di reazioni avverse e sviluppo di resistenza. In questo ambito il processo di drug discovery per la scoperta di nuovi farmaci è ulteriormente ostacolato dagli scarsi incentivi finanziari così come dallo scarso interesse da parte delle grandi industrie farmaceutiche. Per far fronte a tali problematiche l’attenzione della comunità scientifica in ambito accademico si è indirizzata sullo studio dei prodotti naturali (natural products), molecole di origine naturale, e sui relativi analoghi ottenuti tramite sintesi chimica (natural-like compounds) i quali hanno dimostrato di possedere un’attività anti-Leishmania. In particolare, molecole naturali a struttura calconica, come ad esempio il licocalcone A, si sono distinti per l’efficacia anti-Leishmania associata ad una scarsa tossicità. Parallelamente, molteplici analoghi a struttura calconica sono stati sviluppati, caratterizzati da un buon profilo di attività.

Sulla base di tali evidenze, fulcro del progetto è stata la progettazione e la sintesi di alcune serie molecole (Serie 1 e 2) a struttura calconica correlate a composti lead precedentemente identificati e caratterizzate da una variabilità chimica per quanto riguarda i sostituenti agli anelli A e B, come potenziali agenti ad attività anti-Leishmania. La Serie 1 di analoghi è caratterizzata da un anello B 2′, 4′-di-cloro arilico mentre diversi sostituenti sono stati inseriti nelle posizioni 2 e 4 (R e R’) dell’anello A. La Serie 2 è caratterizzata da una funzione piridinica quaternaria avente una catena alifatica lineare e diversi sostituenti sono stati inseriti nelle posizioni 2 e 4 (R e R’) dell’anello A.

2.1.2. Sintesi chimica

La sintesi delle molecole calconiche si è basata sulla reazione di condensazione e aldolica di Claisen-Shmidt tra un acetofenone opportunamente funzionalizzato e l’aldeide disponibile commercialmente (3-O-4-piridin-cardossialdeideo 2,3-di Cl-benzaldeide). Tale reazione è nota per essere di facile esecuzione e quindi di permettere di ottenere efficientemente le molecole desiderate; una reazione di coupling ammidico permette di inserire una funzione ammidica. I calconi a struttura piridinica sono sottoposti alla Reazione di Metsinkin per ottenerne la funzionalizzazione con catene alifatiche lineari. Gli acetofenoni sono sintetizzati a partire dai precursori idrossilati, ai quali sono inserite catene alifatiche attraverso la reazione di alchilazione di Williamson.

2.1.3. Valutazione Biologica

Delle molecole è stata valutata l’attività (test di suscettibilità) nei confronti delle forme vitali del parassita di due specie di Leishmania: L. infantum e L. donovani ed in particolare su quella extracellulare (promastigoti), espressa come IC50 (concentrazione di composto in grado di inibire la crescita del parassita del 50%). Inoltre, per tali molecole è stata valutata la tossicità su cellule di mammifero, tramite saggi di citotossicità su cellule U937 ed espressa come CC50 (concentrazione citotossica di composto in grado di inibire la crescita delle cellule del 50%), al fine di definirne l’indice di selettività (selectivity index, SI), calcolato come rapporto tra CC50 e IC50.

Le molecole con attività antileishmania inferiore a 40 uM sono state riportate. Per le molecole migliori, emerse dai saggi in vitro, sono stati effettuati saggi anche sulla forma intracellulare (amastigoti) di L. infantum e L. donovani. Le stesse molecole sono state valutate su isolati clinici di Leishmania e per quanto riguarda l’effetto sulla liberazione di citochine pro-infiammatorie. Inoltre, il confronto tra determinate caratteristiche strutturali delle molecole analizzate e le relative attività anti-Leishmania, ha permesso di determinare la relazione tra struttura delle molecole e attività biologica (structure-activity relationship, SAR). Lo studio SAR, in ambito chimico farmaceutico, è utile per ricavare informazioni relative all’importanza, ai fini dell’attività, di determinati requisiti chimici, da sfruttare in una fase successiva di ulteriore ottimizzazione del profilo di attività. Un discreto numero di molecole ha dimostrato un interessante profilo di attività anti-Leishmania con valori di IC50 dell’ordine uM e con un SI favorevole. In particolare, le molecole più interessanti in termini di effetto antileishmania e SI sono le seguenti: 3130 (L. infantum: IC50=3.7 uM e SI=81.13; e L. donovani: IC50=4.41 uM, SI=67.99) e 3122 (L. infantum: IC50=4.9 uM e SI=16.58; e L. donovani: IC50=2.41 uM, SI=29.54). 3130 e 3122 sono stati valutati anche sulle forme intracellulari del parassita (amastigoti), le quali sono rilevanti per il trattamento clinico dell’infezione.

3. Studio formulativo: Sviluppo di formulazioni liposomiali e relativa valutazione biologica.

Le molecole lead 3130, 3122 sono state sottoposte a studi formulativi finalizzati al trattamento della forma cutanea dell’infezione che consiste nella inclusione in liposomi, utili per il trattamento intra-lesione. Tali formulazioni sono state preparate mediante metodo dello strato sottile seguito da sonicazione (metodo ad ultrasuoni).

Le formulazioni sono state processate con filtri a porosità 0.45 uM prima di essere utilizzate per i test microbiologici. Gli eccipienti utilizzati sono stati la fosfatidilcolina (PC), un fosfolipide ampiamente utilizzato nella preparazione di vescicole lipidiche o la PC associata alla stearilammina, una molecola lipidica carica positivamente capace di interagire con le fosfatidilserine presenti sulla membrana del parassita, inducendone la morte.

3.1.2. Caricamento delle molecole attive nei liposomi. I sistemi a base di PC sono stati caricati con le molecole denominate Lead 1, calcone 3130 e calcone 3122; mentre quelli a base di PC e stearilammina con il calcone 3130. Tutte le formulazioni ottenute sono state testate negli studi successivi, tranne quella con Lead 1 a causa della presenza di cristalli di attivo nel campione.

3.1.3. Caratterizzazione tecnologica dei liposomi. La valutazione delle dimensioni mediante Dynamic Light Scattering ha mostrato che tutte le vescicole hanno dimensioni nanometriche (inferiori a 300 nm) e una buona omogeneità dimensionale (indice di polidispersione inferiore a 0.3). L’efficienza d’incapsulazione, determinata mediante centrifugazione delle sospensioni liposomiali seguita da filtrazione del surnatante, ha evidenziato una buona capacità dei liposomi di incorporare le molecole attive (superiore al 70 %). La misura della carica superficiale mediante Zeta Potential Analyzer ha evidenziato un potenziale $\zeta$ negativo per i liposomi a base di PC (circa -20 mV) e positivo per quelli contenenti stearilammina (tra +20 e +50 mV).

3.2. Valutazione biologica delle formulazioni. Le formulazioni ottenute sono state testate in vitro in colture di Leishmania. In particolare, quelle contenenti i calconi 3130 e 3122, indipendentemente dal veicolo utilizzato, non sono risultate attive; la causa di tale risultato negativo potrebbe essere attribuita al fatto che, essendo molecole ad elevata lipofilia, potrebbero non essere rilasciate dalla formulazione e quindi non essere disponibili. Il liposoma contenente calcone 3122, molecola contenente una carica positiva e quindi meno lipofila rispetto alle due precedenti, è risultato essere attivo rispetto a 3122 non veicolato. Questo dato suggerisce che per questa molecola, la formulazione liposomiale è un utile strumento per aumentare la biodisponibilità, al contrario di quanto ottenuto per le molecole a elevata lipofilia.

4. Ottenimento di isolati clinici e loro impiego in saggi biologici

L’ottenimento di isolati clinici è stato effettuato presso l’ambulatorio di Dermatologia, tramite biopsie prelevate da lesioni in pazienti affetti da leishmaniosi tegumentaria. Tali isolati sono stati spediti a vari laboratori in Emilia-Romagna (Modena e Cesena), per la coltura, necessaria per il loro impiego nei successivi saggi biologici. In ambito ospedaliero, in caso di leishmaniosi si segue una procedura che inizia con la diagnosi di un nuovo caso, segue un trattamento farmacologico, e termina con l’osservazione della guarigione clinica. In particolare, per ogni caso sospetto, spesso evidenziato mediante dermatoscopia, viene effettuata una biopsia, utile a confermare la diagnosi e, eventualmente, la presenza delle forme amastigoti del parassita. Dalla biopsia viene infatti isolata la specie di Leishmania. Una volta confermato un nuovo caso di infezione, si raccolgono i dati del paziente, cercando di risalire al luogo del contagio; è necessario caratterizzare la lesione che può essere superficiale o estesa, oppure singola o multipla, sotto forma di papula o di nodulo; altre informazioni riguardano la sede della lesione, le dimensioni e se è ulcerata o meno. Il trattamento consiste in una somministrazione intralesionale di Glucantime (meglubina antimonianto), farmaco ad oggi approvato nel trattamento della leishmaniosi tegumentaria, adiuvata da crioterapia. La terapia viene ripetuta periodicamente (ogni due settimane), fino alla guarigione clinica, confermata mediante la dermatoscopia. Per ogni caso di leishmaniosi tegumentaria le informazioni relative al paziente ed alla cura eseguita vengono inserite in un database dell’OMS relativo ai casi della città di Bologna.

5. Conclusioni

Lo studio si è focalizzato sulla progettazione, sintesi e caratterizzazione strutturale di due serie di molecole a struttura calconica correlate ai lead compounds. Tali molecole sono state successivamente testate in vitro su colture di Leishmania mediante test di suscettibilità permettendo di identificare un discreto numero di molecole in grado di inibire la proliferazione del parassita. Per tali derivati è stata valutata la tossicità sistemica su colture di macrofagi, ai fini di determinarne l’indice di selettività. Due composti (3130 e 3122) sono risultati interessanti in quanto attivi anche sulla proliferazione della forma parassitaria intracellulare e sono stati inclusi in liposomi al fine di ottenere una formulazione farmaceutica idonea alla somministrazione locale, finalizzata al trattamento della leishmaniosi cutanea o tegumentaria. Inoltre, le molecole dotate di una buona attività antiparassitaria sono state sottoposte a studi in silico ai fini di indagare quale sia il bersaglio molecolare (target) coinvolto nell’attività inibente la proliferazione del parassita (Università di Bari). Nello specifico, come target è stata studiata la famiglia di enzimi appartenenti alla classe delle FAD/NADH deidrogenasi. È in fase di preparazione un manoscritto contenente i risultati sopra citati da sottomettere all’attenzione di una rivista scientifica a carattere chimico-farmaceutico.